Благодаря новым технологиям появились возможности выделять из крови ВИЧ-инфицированных пациентов антитела широкого спектра действия (способные нейтрализовать самые разные варианты ВИЧ). Эти антитела, как оказалось, присутствуют у довольно большого числа ВИЧ-инфицированных пациентов.
Как большинство моих читателей знает, на работе я сейчас занимаюсь ВИЧ-вакцинами. До этого я тоже занимался ВИЧ, но не вакцинами, а в область вакцин пришел лет 6 назад, причем пришел изрядным скептиком. До сих пор, рассказывая о текущем состоянии ВИЧ-вакцин, я всегда использую слайд, суммирующий основные научные препятствия на пути создания такой вакцины. Этот слайд практически не меняется от года к году. Последний раз он изменился в 2009 году, когда впервые клиническое испытание показало небольшую эффективность вакцины в предотвращении ВИЧ-инфекции. Сейчас, похоже, пора опять немного изменить этот слайд. С прошедшей в марте конференции Keystone я вернулся куда большим оптимистом, чем когда-либо. В этом посте я расскажу почему.
Причина раз: Мы узнали, что Env уязвим.
Пожалуй, самой многообещающей мишенью для вакцины является Env, белок оболочки ВИЧ, потому что это единственный вирусный белок на поверхности вируса и именно его должна распознавать иммунная система, если мы хотим предотвратить инфекцию. Однако все 30 с лишним лет с момента открытия ВИЧ, этот белок во многом оставался загадкой и проблемой для создания вакцины. Env - тример (состоит из трех одинаковых частей), и каждая часть в тримере состоит из двух субъединиц (gp41 и gp120). gp41 заякорен в мембрану вируса, а gp120 сидит на gp41, как шляпка гриба на ножке. Уязвимые части Env спрятаны в центре белка, а наружняя его часть состоит из участков, которые очень вариабельны и несут множественные сахара, что затрудняет иммунный ответ на этот белок.
Эту проблему усложняет тот факт, что Env мобилен и нестабилен. Мобильность его проявляется в том, что этот белок постоянно "дышит", слегка меняя свою форму, даже без дополнительных сигналов извне. А в ответ на связывание с клеточными рецепторами он вообще радикально меняет свою форму. При этом вся эта конструкция очень нестабильна и легко разваливается на составляющие части. И изучать подобную структуру и пытаться создать из нее эффективный иммуноген для вакцины необычайно трудно.
Белок Env в закрытом (слева), полуоткрытом (в середине), и полностью открытом (справа) состоянии. В верхнем ряду показана молекулярная структура белка, вид сверху. Нижние два ряда показывают изменение структуры схематично. (Источник: Merk & Subramaniam, 2013, Curr Opin in Struct Biol)
Последние пять лет в области антител шла натуральная революция. Благодаря новым технологиям появились возможности выделять из ВИЧ-инфицированных пациентов антитела широкого спектра действия (способные нейтрализовать самые разные варианты ВИЧ). Эти антитела, как оказалось, присутствуют в довольно большом проценте ВИЧ-пациентов. Их обнаружение важно тем, что подобные антитела указывают нам на участки белка, которые уязвимы для иммунной системы и которые присутствуют в самых разных вариантах ВИЧ (иначе бы эти антитела не могли их нейтрализовать). Этих антител навыделяли уже десятки. На сегодняшний день обнаружением очередного антитела широкого действия никого не удивишь. Однако в сумме всех этих работе обнаружилась довольно удивительная вещь. Если раньше считалось, что на поверхности белка оболочки есть лишь 3-4 места, уязвимых для антител, то после картирования мест в которых связываются недавно выделенные антитела широкого действия оказалось, что таких мест очень много. Трюк заключается в том, чтобы антитело связывалось исключительно с уязвимым не-вариабельным районом белка и чтобы оно связывалось таким образом, что небольшие изменения в этом районе не влияли бы радикально на связывание. При инфекции такие антитела вырабатываются через два-три года, но лишь в некоторых людях. Как именно добиться того, чтобы в результате вакцинации рутинно вырабатывались именно такие антитела, пока остается неизвестным, но сам факт того, что это возможно - очень обнадеживает.
Белок Env на котором разными цветами помечены места, в которых связываются антитела широкого спектра действия (помечена только одна из трех субъединиц белка). Слева - вид сбоку, справа - вид сверху. Источник: Derking R, et al. (2015). PLoS Pathogens
Причина два: Мы изучили пути формирования антител широкого действия
Помимо выделения антител широкого действия, ряд групп также в течение последних лет восьми тщательно изучал сам процесс формирования этих антител, отслеживая во времени образцы из пациентов, начиная почти с момента инфекции и заканчивая появлением этих антител. Как известно, иммунная система постоянно создает огромное разнообразие потенциальных антител, большая часть которых идет в расход и только редкие варианты, которым повезло приобрести способность связываться с патогеном, остаются и начинают эволюционировать в эффективные антитела. Так вот, выяснилась довольно интересная вещь. Создаваемое разнообразие не полностью случайно, а имеет некоторые закономерности и в этих закономерностях можно найти такие, которые с большей вероятностью ведут к созданию антител широкого спектра действия против ВИЧ. Например, антитела широкого спектра действия, атакующие в Env сайт связывания с клеточным рецептором CD4, как правило появляются из предшественников антител, созданных с участием гена VH1-2*02. Что особенно интересно, их эволюция от начальных антител, которые довольно плохо узнают Env, к антителам широкого действия идет по повторяющимся путям и ведет к повторяющимся свойствам. Подобно тому как птицы и летучие мыши независимо приобрели в ходе эволюции крылья, антитела в разных людях независимо приобретают схожие свойства. Для меня это было довольно неожиданным результатом.
Особенно показателен в этом смысле один недавний эксперимент (представленный на мартовской конференции), в котором пытались воспроизвести появление одного конкретного антитела широкого действия, VRC01. Про это антитело известно, из какого предшественника оно произошло и как именно связывается с Env. Все антитела состоят из двух частей, так называемых тяжелой и легкой цепи. VRC01 в ходе эволюции приобрело следующие свойства: Его тяжелая цепь стала чуть длиннее и приобрела мутации, позволяющие более эффективно связываться с Env, а легкая цепь стала короче и таким образом не мешает тяжелой цепи проникнуть вглубь Env и связаться и инвариабельным участком.
Группы Билла Шифа и Дэвида Немази в Скриппсе сделали следующий эксперимент. Они сделали трансгенную мышь, у которой был предшественник тяжелой цепи VRC01. Получающиеся в такой мыши антитела состояли из этой тяжелой цепи и разных легких цепей, образующихся естественным образом у мышей. Этих мышей они иммунизировали Env (они использовали довольно уникальный белок, но сейчас не будем отвлекаться) и смотрели в какую сторону будут эволюционировать эти антитела. Результат получился очень впечатляющий. Во-первых, получающиеся антитела имели короткую легкую цепь. Во-вторых, многие из мутаций в тяжелой цепи были идентичны мутациям, которые приобрело VRC01 в ходе своей эволюции. То есть эволюция антитела в этой мыши очень близко повторила эволюцию VRC01. Это говорит не просто о том, что такое возможно, но также о том, что на общем ландшафте потенциальных возможностей эволюции антител существуют "долины", в которые антитела неизбежно скатываются если их стимулировать определенным образом. Это, в свою очередь, означает что образование антител широкого спектра действия может быть не редким курьезом, а реальной стратегией для массовой вакцинации.
Слева схематически показаны изменения, произошедшие при эволюции VRC01 - набор определенных мутаций в тяжелой цепи антитела и отбор короткой легкой цепи. Справа показано, что схожие изменения произошли при иммунизации трансгенных мышей, имеющих тяжелую цепь предшественника антитела VRC01.
Причина три: Мы научились создавать Env правильной формы
Я уже писал выше, что нестабильность Env является огромной проблемой на пути создания ВИЧ вакцин. Примерно 17 лет назад группа Джона Мура начала заниматься вопросами стабилизации Env. Частично основываясь на том, что было известно о строении Env, а частично используя методы тыка и удачи, им недавно удалось подойти к созданию стабильного белка оболочки с минимальными модификациями в его последовательности. Однако тот факт, что белок вышел стабильным, не означает что он правильной формы. Но тут пришлись кстати многочисленные антитела широкого спектра действия, которые появились в таком разнообразии за последние 5 лет. Многие из таких антител связываются только с нераспавшимся и неизмененным Env, например потому что они связываются в местах стыковки субъединиц тримерного Env. Если белок развалился или серьезно изменил свою форму, то они связаться уже не могут. Таким образом, эти антитела могут быть использованы для того, чтобы протестировать в какой форме находится Env. И с их помощью было показано, что стабилизированный белок аккуратно воспроизводит Env на поверхности вируса.
На создание первого такого белка ушло примерно 15 лет. За последние год-два эта технология была применена в массовых масштабах и появились новые варианты. На мартовской конференции одна из групп представила результаты по созданию более чем 40 вариантов подобных белков, во многом отражающих разнообразие ВИЧ в мире. Более того, сейчас уже тестируются новые подходы, которые обещают существенно упростить создание и производство таких белков. Похоже, что наступает целая новая эпоха, в которой большинство предыдущих подходов к созданию белков для ВИЧ вакцин окажется заброшенным, а вся область переключится на новые белки, которые намного лучше воспроизводят белок на поверхности вируса.
Причина четыре: Мы узнали как выглядит Env
Ранее, из-за нестабильности Env, для получения его кристаллов приходилось идти на компромиссы - удалять сахара и/или особо-вариабельные особо-мобильные участки белка. Подобные манипуляции ставили под сомнение полученные структуры и поэтому мы очень плохо представляли себе как именно выглядит Env в нетронутом виде на поверхности вируса. Получение стабильных форм Env частично решило проблему кристаллизации, но не до конца, потому что осталась мобильность как самого Env, так и сахаров на его поверхности.
Как это часто бывает в науке, решение проблемы пришло с неожиданной стороны. Вместо того, чтобы получать кристаллы, народ додумался вот до чего: Стабилизированные формы белка оболочки очищаются и фотографируются электронным микроскопом, сначала прямо сверху, а потом немного под углом. Делается большое количество таких микрофотографий, на них компьютер автоматически находит тысячи индивидуальных белков и вырезает соответствующие фргаменты. На каждом фрагменте индивидуальная молекула белка выглядит размазанной и нечеткой, но с помощью специальной компьютерной программы все эти картинки усредняются, из них вычитается шум, и в результате получается картинка с супервысоким разрешением, по которой можно восстановить трехмерную структуру белка вплоть до атома. Такое разрешение раньше было возможно лишь для кристаллографии.
Автоматически вырезанные и отсортированные фотографии белка Env. Трудно себе представить, но из подобных зернистых фотографий с помощью крутых алгоритмов современные компьютеры умудряются получить струкутры, сравнимые по разрешению с кристаллографией.
В 2013 году были опубликованы структуры полученные подобным образом для двух вариантов ВИЧ. В 2014 году такая структура была получена еще для одного варианта вируса. На прошедшей в марте конференции Keystone были показаны структуры еще 10 вариантов. Технология "созрела" и сейчас получать подобные структуры будет довольно рутинным делом. А это означает, что мы получаем возможность подробно изучить, как именно устроен белок оболочки, и как антитела нейтрализуют его.
Причина пять: Новые вакцины с Env
В результате всех вышеописанных работ было подтверждено то, что многие давно подозревали - большинство белков, которые до сих пор использовались в ВИЧ вакцинах, существенно отличаются по форме от Env на поверхности вируса. Поэтому не удивительно, что предыдущие вакцины вызывали появление антител с очень низкой активностью против ВИЧ. Для вакцины нужен белок, который бы аккуратно воспроизводил белок на поверхности вируса. Сейчас у нас есть такие белки, но приведут ли они к более эффективным вакцинам? Это пока остается неясным, хотя первые данные обнадеживают. Группа Джона Мура, которая создала первый стабильный белок, успела вакцинировать им мышей, кроликов, и макак. В мышах результаты получились довольно слабые, не намного лучше того, что наблюдалось раньше. Зато в кроликах и макаках получилось кое-что, чего раньше получить не удавалось.
Дело в том, что разные варианты ВИЧ отличаются по чувствительности к антителам. Их грубо делят на три категории. Вирусы первой категории очень чувствительны к антителам и даже не очень эффективные антитела их нейтрализуют. Вирусы второй категории намного более устойчивы к нейтрализации антителами и большинство антител имеют на них очень ограниченный эффект, хотя в больших концентрациях они таки действуют. И наконец третья категория вирусов чрезвычайно устойчива к действию подавляющего большинства антител.
Ранее в вакцинациях удавалось получить только антитела, способные нейтрализовать вирусы первой категории. В своем докладе на конференции, Рохиер Сандерс показал, что при вакцинации стабилизированным белком впервые получились антитела, которые нейтрализовали вирус второй категории. К сожалению, эти антитела были активны только против одного варианта ВИЧ (на основе которого был создан этот стабильный Env), и не имели эффекта на другие вирусы второй категории. Узкая специфичность иммунного ответа - довольно стандартная проблема при вакцинации и данный подход ее очевидно не решает. Но сам факт получения нейтрализации против вирусов второй категории чрезвычайно радует, потому что это означает, что взят один из давних барьеров на пути создания ВИЧ вакцины.
Что дальше
Совпадение ли, или же эффект синергии, но за последние несколько лет случилось несколько качественных скачков в областях связанных с белком оболочки ВИЧ и вакцинами, которые имеют своей целью выработать антитела к этому белку. В результате открываются очень интересные новые возможности. Они не означают, что вакцину от ВИЧ сейчас будет создать легко, но из списка дюжины принципиальных проблем для ее создания, сейчас можно вычеркнуть одну-две.
P.S: Пост был написан по мотивам статьи , которую мы с Ноем Сазером написали для IAVI Report.
