Ученые продемонстрировали потенциал технологии CRISPR-Cas9 для удаления генома ВИЧ из ДНК инфицированных клеток. Они также определили некоторые последствия этого и начали исследовать, как можно смягчить эти побочные эффекты.
Фото: CDC/Unsplash
Ученые продемонстрировали потенциал технологии CRISPR-Cas9 для удаления генома ВИЧ из ДНК инфицированных клеток. Они также определили некоторые последствия этого и начали исследовать, как можно смягчить эти побочные эффекты. В одном исследовании доктор Мишель Лай и его коллеги из Пизанского университета продемонстрировали способность CRISPR-Cas9 удалять генетический материал ВИЧ из инфицированных клеток, а также исследовали, могут ли вырезанные участки ДНК реинтегрироваться и снова начать размножаться.
В другом исследовании доктор Джонатан Херсковиц и его команда из Университета Небраски показали, что при манипулировании CRISPR-Cas9 для нацеливания на несколько участков в двух наиболее важных генах ВИЧ репликация вируса в инфицированных клетках почти полностью прекращается – без непосредственного очевидного повреждения клеточной ДНК. У людей ВИЧ действует, прикрепляясь к клетке и высвобождая ее генетический материал, который затем превращается в ДНК клеткой, в которую он вторгся. Эта ДНК затем интегрируется в ДНК хозяина и, если антиретровирусная терапия (АРТ) не ингибирует ее, будет продолжать создавать дальнейшие копии вируса.
CRISPR-Cas9 (Кластеризованные Регулярно чередующиеся Короткие палиндромные повторы – CRISPR-ассоциированный белок 9) - это молекулярный инструмент, адаптированный на основе метода, который бактерии используют для удаления вирусного генетического материала, интегрированного в их собственную ДНК. По сути, это позволяет ученым выбрать последовательность известного генетического материала (например, часть последовательности генома ВИЧ) и дать команду ферменту пойти и вырезать этот материал из последовательности ДНК. Теоретически это означает, что генетический материал ВИЧ, хранящийся в ДНК людей, живущих с ВИЧ, может быть удален. Исследователи из Пизы проверили это понятие в лаборатории (in vitro), а также исследовали, что случилось с вирусной ДНК, которая была вырезана. Сначала они взяли группу клеток и, используя ретровирусный вектор, подобный ВИЧ, вставили в клетки модифицированную нить ВИЧ-материала. Затем клетки начали вырабатывать белок, который исследователи могли измерить, предполагая, что, как и в случае ВИЧ-инфекции у человека, когда вирус высвобождает свой белок р24, ВИЧ-материал был интегрирован в ДНК клеток.
Затем они ввели комплекс CRISPR-Cas9, который был нацелен на определенную часть ВИЧ-материала, в надежде, что затем он удалит вирусную ДНК ВИЧ из инфицированных клеток и таким образом прекратит производство белка. Областью, на которую они нацелились, был длинный терминальный повтор (LTR) – области в конце каждой нити вирусного генетического материала, которые "включают" механизм клетки-хозяина, чтобы она начала производить вирусные белки. Исследователи искали признаки того, что активная выработка белка ВИЧ происходила в клетках, подвергнутых воздействию CRISPR-Cas9, и обнаружили, что через пару дней она действительно почти полностью прекратилась. Они также хотели посмотреть, что произойдет со всем иссеченным вирусным генетическим материалом. Они обнаружили, что он может образовывать небольшие круги кольцевой ДНК, которые сохраняются в клетках по крайней мере в течение двух недель после введения комплекса CRISPR-Cas9.
Считалось, что в конечном итоге эти фрагменты ДНК разрушатся или будут разбавлены путем повторного деления клеток. Однако иногда исследователи обнаруживали, что они снова соединялись вместе и образовывали полные цепочки генетического материала ВИЧ. В определенных манипулируемых лабораторных условиях, созданных исследователями, этот генетический материал мог создать некоторые строительные блоки вируса ВИЧ и, таким образом, теоретически мог продуцировать инфекционный вирус, создавая потенциальный барьер для использования CRISPR-Cas9 в качестве полного излечения от ВИЧ. Однако эта проблема может быть устранена одновременным, надеюсь, временным применением антиретровирусной терапии.
Исследователи из Небраски изучили некоторые другие проблемы, с которыми сталкивается технология CRISPR-Cas9. Учитывая, что существуют тысячи штаммов вируса ВИЧ с большим генетическим разнообразием и что ВИЧ продолжает мутировать после заражения, они хотели убедиться, что технология не станет избыточной из-за большого количества штаммов, каждый из которых имеет несколько иной генетический материал. Кроме того, они рассмотрели, как лучше всего такое лечение будет применяться к клеткам человека в реальных условиях жизни (in vivo).
"Существуют препятствия, которые, если их не преодолеть, могут ограничить CRISPR-CAS9 просто интригующим лабораторным инструментом".
Эта группа нацелилась на несколько и разных областей генома ВИЧ, подлежащих удалению, а не на один регион, на который нацелилась первая группа исследователей.
Гены ВИЧ tat и rev кодируют белки, которые заставляют инфицированные клетки быстро вырабатывать гораздо большее количество вируса ВИЧ. Они остаются относительно неизменными при различных штаммах вирусов. Исследователи обнаружили, что, когда они одновременно нацелились на эти гены с помощью комплекса CRISPR-Cas9 под названием TatDE, он разрезал вирусную ДНК в нескольких местах. Они смогли почти полностью блокировать размножение вируса в ВИЧ - инфицированных клетках с меньшим отскоком вируса, чем при нацеливании только на LTR, как в исследовании Pisa.
Что касается того, как CRISPR-Cas9 может быть осуществимо доставлен в клетки человека, группа из Небраски использовала различные методы, чтобы увидеть, что будет эффективным.
Исследователи протестировали технологию мРНК (мессенджерной РНК), аналогичную той, которая использовалась в недавних вакцинах COVID-19 Pfizer и Moderna. Это вводит генетический материал через маленькие жировые капельки в клетки, которые затем начинают вырабатывать комплекс CRISPR-Cas9. Они обнаружили, что это очень эффективный способ реализации CRISPR-Cas9.
Учитывая его проверенный послужной список безопасности в качестве метода доставки, мРНК действительно предоставляет захватывающий потенциальный путь для передачи этой технологии из лаборатории человеку.
Еще одна проблема, которая была поднята в отношении CRISPR-Cas9, связана с внесением изменений "вне цели": может ли фермент Cas9, хотя и нацеленный на вирусную ДНК, которая была вставлена в ДНК инфицированных клеток (хозяина), ошибочно вырезать часть собственного генетического материала клетки-хозяина?
Авторы статьи проанализировали клетки, подвергшиеся обработке CRISPR-Cas9, и, в частности, рассмотрели области в геноме человека, которые система Cas9 с наибольшей вероятностью может принять за ДНК ВИЧ. Они обнаружили, что ни в одном из этих регионов не было такого "нецелевого" редактирования. Однако авторы не изучили всю оставшуюся ДНК клеток, и поэтому остается вероятность того, что нецелевые изменения могли существовать, но просто не были найдены.
Прежде чем можно будет приступить к какому-либо исследованию на людях, необходимо провести исследования всего генома; удаление критического гена может иметь тяжелые последствия для любого, кто принимает лечение CRISPR-Cas9.
Технология CRISPR-Cas9 постоянно развивается. Эти исследования каким-то образом доказывают, что в лабораторной посуде можно удалить вирусную ДНК из инфицированных клеток человека. Они демонстрируют, что путем тестирования различных мишеней для фермента Cas9 они могут повысить его эффективность и изучили возможные и безопасные способы доставки такого лечения клеткам.
Но прежде чем люди, живущие с ВИЧ, и лечащие их клиницисты обрадуются перспективе излечения, важно отметить, что эти исследования проводились в контролируемых лабораторных условиях с узким диапазоном клеточных линий. Чтобы это лечение было эффективным у людей, оно должно было бы достичь и быть эффективным в каждой клетке, в которую интегрирована ДНК ВИЧ. Необходимо провести полное секвенирование генома нескольких клеточных линий, прежде чем можно будет полностью определить, что нет вредных или даже потенциально смертельных "нецелевых" изменений.
Даже при наличии этого необходимо ответить на другие вопросы, такие как, например, как долго ли продолжать антиретровирусную терапию после лечения CRISPR-Cas9. Хотя эти выводы многообещающи, эти исследования в настоящее время все еще предоставляют только доказательство концепции. Дальнейшие исследования будут сосредоточены на том, как превратить технологию CRISPR-Cas9 в эффективное и безопасное средство лечения ВИЧ, но существуют препятствия, которые, если их не преодолеть, могут привести к тому, что CRISPR-CAS9 станет просто интригующим лабораторным инструментом.
