Вирусная оболочка ВИЧ-1 формируется из плазматической мембраны клетки-хозяина. Исследователи из Англии и США обнаружили, что ингибирование сфингомиелиназы nSMase2, расщепляющей один из компонентов мембраны, нарушает созревание вирусных частиц и снижает их инфекционность.
Алёна Харламова/Фото : РИА Новости/Резников
Сборка вирионов ВИЧ-1 происходит на внутреннем слое плазматической мембраны специализированных высокоупорядоченных микродоменах. Их размер и стабильность регулируется активностью нейтральной сфингомиелиназы 2. Недавнее исследование посвящено роли этого фермента в сборке вирусных частиц — оказалось, что ингибирование его работы снижает инфекционность образующихся вирионов.
Процесс сборки активируется с помощью вирусного белка-предшественника Gag — Pr55Gag (обозначаемого далее Gag). Этот белок содержит несколько структурных и функциональных доменов, которые обеспечивают сборку и выход вируса из клетки. Он синтезируется в цитозоле и затем перемещается к месту сборки вирионов.
Было показано, что сборка ВИЧ-1 происходит в мембранных микродоменах, которые обогащены холестерином, сфингомиелином и фосфолипидами. Особый липидный состав микродоменов и их определенное сходство с вирусной оболочкой играют критическую роль в репликации ВИЧ-1 и, возможно, других ретровирусов. Однако взаимосвязь между липидным профилем плазматической мембраны и продукцией ретровируса остается малоизученной.
Сфингомиелин превращается в церамид и фосфорилхолин под действием ферментов из семейства сфингомиелиназ, которые классифицируются на основе их оптимума рН. Наиболее широко изучена нейтральная сфингомиелиназа 2 (nSMase2); она преимущественно локализована вблизи ПМ. Предыдущие исследования показали, что церамид, продуцируемый nSMase2, может влиять на инфекционность ВИЧ. Теперь же ученые определили роль этого фермента в регуляции поздних стадий репликации ВИЧ-1.
Чтобы выяснить, влияет ли nSMase2 на сборку, высвобождение и созревание ВИЧ-1, авторы блокировали действие этого фермента в клетках, продуцирующих вирусы. После обработки клеток селективным ингибитором nSMase2 — PDDC — процессинг и высвобождение Gag отслеживали при помощи вестерн-блоттинга с иммуноглобулином против ВИЧ. Оказалось, что PDDC дозозавимимо ингибировал процессинг Gag — об этом свидетельствовали накопление белка-предшественника Gag, промежуточных продуктов процессинга p49 и p41, а также уменьшение количества зрелых доменов Gag в клетках и в вирусных лизатах. Аналогичные результаты были получены при использовании структурно отличающегося низкомолекулярного ингибитора nSMase2.
Нокаут гена nSMase2 в продуцирующих вирус клетках с использованием лентивирусной миРНК также нарушал процессинг Gag.
Чтобы определить, до какой степени блокировка nSMase2 снижает инфекционность формируемых вирионов ВИЧ-1, учёные использовали индикаторную клеточную линию TZM-bl. Обработка этих клеток PDDC дозозависимо уменьшала инфекционность производимого вируса — при использовании самых высоких (10 µM) концентраций наблюдалась разница с исходным уровнем более чем в 100 раз. Измерение активности обратной транскриптазы показало, что ингибирование nSMase2 также подавляет репликацию вирусного генома.
При помощи просвечивающей электронной микроскопии авторы изучили тонкие срезы клеток, обработанных PDDC. Они выявили нарушения в морфогенезе ВИЧ: у вирусных частиц отсутствовали конические ядра, и в целом морфология соответствовала незрелым вирионам. В то же время криоэлектронная томография структур Gag в присутствии PDDC и без показала, что обработка PDDC не оказывает существенного влияния на фолдинг этого белка.
При изучении влияния nSMase2 на процессинг и созревание Gag в контексте других ретровирусов исследователи обнаружили, что подавление этого фермента также нарушало созревание ВИЧ-2 и вируса иммунодефицита обезьян, намного слабее влияло на вирус инфекционной анемии лошадей и вирус иммунодефицита кошек, а на вирус мышиного лейкоза не оказывало никакого эффекта.
Результаты работы исследователей демонстрируют ранее не известную роль фермента nSMase2 в созревании лентивирусов приматов и открывают новые возможности по разработке антиретровирусной терапии, направленной на его ингибирование.
